流式细胞术是目前应用最广泛的细胞检测技术之一，广泛用于免疫学、血液学以及临床检测。血液是最常见的流式样本来源之一，它本身就是天然的单细胞悬液，能够直接用于检测。但一个现实问题是：血液中红细胞数量远远多于白细胞。在分析目标是白细胞（如淋巴细胞、单核细胞、粒细胞）时，过多的红细胞会干扰结果，使得目标群体难以区分。这也就要求在实验前需要对血液进行处理，通过合适的方法去除红细胞，方便后续研究的开展。
目前血液样本常用的处理方法有：红细胞裂解法和密度梯度离心法。那处理血液样本时这两种方法改如何选择呢？
一、红细胞裂解法
红细胞裂解法是日常实验中处理血液样本的常用方法。通过专门的裂解液，将红细胞选择性破坏，而保留大多数白细胞。裂解完成后，样本即可进入后续染色或检测步骤。
图1. 红细胞裂解液处理人外周血
1. 优点
① 操作快速简便：整个过程只需几分钟，适合批量样本处理；
② 白细胞保留率较高：淋巴细胞、单核细胞和粒细胞都能较好地保存。
2. 缺点
① 细胞活性可能降低：相比密度梯度法，裂解过程中细胞功能可能受到轻微影响；
② 对操作条件敏感：裂解时间过长会损伤白细胞，过短则裂解不完全，导致红细胞残留；
③ 后续应用有限：若样本需要继续培养或功能实验，裂解处理可能带来干扰。
3. 实验注意事项
① 严格控制时间：通常在说明书推荐时间内完成，避免裂解时间过长对其他细胞产生影响；
② 注意实验目标：如果研究对象是红细胞（如贫血或血红蛋白病研究），则不应使用裂解；后续应用需谨慎；若计划进行细胞培养或冻存，裂解处理可能降低细胞活性，需要提前评估。
二、密度梯度离心
密度梯度离心根据血液中不同细胞的沉降系数和密度差异，通过梯度介质（如 Ficoll、Percoll）分层分离细胞群。
图2. 人外周血通过Ficoll分离液提取PBMC示意图
1. 优点
① 纯度高：分离效果好，获得的细胞纯净度高；
② 细胞活性保持好：适合后续的功能性实验，如增殖实验、细胞因子分泌检测、T细胞功能研究等。
2. 缺点
① 操作繁琐：整个过程往往需要30分钟以上，步骤复杂；
② 技术要求高：需要熟练操作人员，才能稳定获得清晰的分层；
③ 细胞保留率有限：部分白细胞（如中性粒细胞）会被去除，只获得淋巴细胞和单核细胞。
3. 实验注意事项
① 离心速度需平稳：加速和减速过程应尽量温和，以保持分层清晰；
② 注意物种差异：人、小鼠、大鼠的PBMC密度不同，分离液不可混用，人的PBMC是在1.077 g/mL、小鼠、大鼠的则是在1.084 g/mL。
三、两种方法的应用场景
全血免疫表型快速分析： 若目标是快速分析全血中白细胞亚群的数量和表面标记（如淋巴细胞分型、单核细胞数目等），红细胞裂解法常为首选。该方法简便快捷、可直接对大量样本进行处理。尤其在临床检测或大量样本筛查时，裂解法能够有效剔除红细胞，保留绝大部分白细胞进行检测。
高纯度PBMC功能分析： 若下游实验需要高纯度的淋巴细胞/单核细胞群体（例如体外细胞培养、细胞毒性实验、细胞因子检测等），密度梯度离心更加适合。该方法可获得相对纯净的单核细胞（PBMC）群体，并最大程度地保持细胞活性。需要注意的是，梯度离心可能导致部分白细胞（如极少量的淋巴细胞或细胞碎片）丢失，并且未富集的中性粒细胞被去除。
细胞种类需求：如果研究需要保留和分析中性粒细胞等密度较高的白细胞群（如对粒细胞功能的研究），则应使用裂解法；若只关注淋巴细胞和单核细胞，梯度离心能够提供更高纯度的样本。
四、总结
综上，根据实验目的和后续分析需求选择前处理方法：若实验重点是快速筛选全血中各类白细胞的表型特征，或样本数量大、对细胞纯度要求一般，可优先考虑红细胞裂解法，其操作简单高效。若下游需要高纯度PBMC进行细胞培养和功能测定，则宜采用密度梯度离心，以获取纯净度更高且活性较好的单核细胞群。需要注意，没有一种方法适用于所有情况，应根据实验需求综合权衡操作简便性、细胞纯度和活性等因素进行选择。在实际操作中，也可根据需要组合使用两种方法，例如：先用裂解法快速去除红细胞，再对特定细胞群体进行梯度分离，以达到更优效果。
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