流式细胞术的多色分析中，精准解析荧光素的光谱图是实验成功的基石。随着技术的发展，流式细胞术的多色应用变得日益普及，光谱图作为荧光素选择和实验设计的核心工具，扮演着越来越重要的角色。那如何正确理解和解读荧光光谱图，选择适合的荧光素组合。
一、 光谱图的核心参数及其意义
我们需要关注光谱图的哪些数据？首先是横纵坐标，横坐标是波长，纵坐标是荧光强度，通常是一个相对值，反映了该波长下发光的强弱；然后是激发光（Excitation）光谱和发射光（Emission）光谱，通过两个光谱我们可以知道这个荧光素激发光和发射光的范围；最后是最大激发光（Ex Max）和最大发射光（Em Max），这两个数据可以帮我们确定荧光素在流式细胞仪上适用于哪个激光器和检测通道。
图1. FITC光谱图
图1展示的是FITC的光谱图，通过光谱图我们可以得到以下信息：虚线是FITC的激发光（Excitation）光谱，实线是FITC的发射光（Emission）光谱，FITC的最大激发光是495 nm，最大发射光是519 nm，在流式细胞仪上最适合的激光器是488 nm，最佳检测通道数519 nm附近（一般选择的是530/30滤光片）。
二、根据荧光素光谱判断不同荧光在多色panel中的兼容性
1. 检查荧光的发射光谱，如果发射光谱没有重叠或者重叠程度比较小，那荧光可以兼容在一个panel中，如图2所示。
图2. 不同荧光素光谱图
2. 发射光谱重叠严重，但是激发光谱没有重叠或者重叠程度比较小，这样的荧光也是可以在一个panel中兼容的。如FITC与BV510，通过它们的光谱图（图3）可以看到二者的发射光光谱重叠非常严重，但是二者的激发光谱叠程度比较小，这样二者用到的激光器不同。
图3. FITC与BV510光谱图
FITC由488 nm激发，BV510由405 nm激发。405 nm激光器可低效激发FITC的荧光（图4），488 nm几乎激发不了BV510的荧光（图5），所以二者可以在同一个panel中共用。
图4. 405 nm激光器激发BV510和FITC
图5. 488 nm激光器激发BV510和FITC
3.激发和发射光谱重叠严重的荧光素，它们是不可以出现在同一个panel中的。如：FITC、AF488与GFP，它们的激发和发射光光谱几乎重叠在一起（图6），三者不可共用。这也是我们在流式配色中常提到的，如果样本带有GFP的自发荧光，不能选择FITC/AF488这一类的荧光素。
图6. 激发和发射光谱重叠严重的荧光素
通过比较各荧光的激发光谱与发射光谱，可以直观地预判荧光之间的兼容程度。原则是：发射光谱重叠越小，兼容性越好（如FITC和APC）；发射光谱重叠大，激发光谱重叠越小，兼容性越好（如BV421和BV750）；反之，荧光素的兼容性越差（如FITC和AF488）。
三、如何通过光谱图寻找替代荧光
在一些情况下，可能因为荧光素的亮度不足、设备配置不匹配或其他原因，原定的荧光素无法使用。这时，光谱图可以帮助我们寻找合适的替代荧光素。
选择替代荧光素时的原则：替代荧光素的激发和发射光谱应与原荧光素尽可能相似，且与其他荧光素的发射光谱重叠程度小。此外，还应考虑荧光素的亮度和稳定性，确保在实验过程中能够获得清晰的信号。例如：当体系偏酸性时，FITC的荧光强度会受影响，可以选择AF488作为替代，因为两者的光谱特性非常相似，AF488在光照和不同pH条件下更稳定。
表1. FITC与AF488对比
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荧光 |
亮度 |
特点 |
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FITC |
中等 |
FITC对pH变化和光敏感，荧光强度相对较暗，配色时尽量与高表达抗原配对。 |
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AF488 |
中等 |
AF488 相较于FITC，在光照和不同pH条件下更稳定。 |
四、通过光谱图和流式细胞仪的配置选择合适的荧光
除了荧光素的光谱特性外，选择合适的荧光素还需要考虑流式细胞仪的配置。不同仪器的激光器和检测通道不同，因此在选择荧光素时，需要确保它们与仪器配置兼容。
1. 激光器与荧光素的匹配：首先，了解流式细胞仪上可用的激光器波长。选择的荧光素必须与现有激光器波长匹配。如果流式细胞仪没有405 nm的激光器，就不能选择需要该波长激发的荧光素。表2中展示的是目前市面上流式细胞仪配备的激光器类型及激光器可激发的一些常见荧光素。
表2. 流式细胞术中的常见激光器
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激光器 |
波长 |
激光器的常用荧光素 |
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紫外(UV) |
355 nm |
DAPI，Hoechst，LIVE/DEAD Blue，BUV系列 |
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紫色 |
405–407 nm |
Pacific Blue，eFluor 450，Pacific Orange，eFluor 506，Super Bright系列，BV系列，CFP |
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蓝色 |
488 nm |
FITC，Alexa Fluor 488，Dylight 488，PE，PE tandems，PerCP，PerCP tandems，PI，7AAD，eGFP，YFP |
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绿色 |
532 nm |
PE，PE tandems，Alexa Fluor 532，PI，mCherry，RFP |
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黄色 |
561-568 nm |
PE，PE tandems，PI，mCherry， RFP |
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红色 |
633-647 nm |
APC，Alexa Fluor 647，Alexa Fluor 700，APC tandems |
2. 检测通道的选择：流式细胞仪的每个检测通道配备有特定的滤光片，这些滤光片只能检测特定的波长，如530/30，那检测的就是530±15 nm波长范围的荧光。因此，荧光素的发射峰值应尽量与检测通道的中心波长匹配，一个荧光素通常应在其发射峰附近的通道中进行检测。
总之，熟练掌握光谱图的解读方法，不仅是流式多色panel设计的技术前提，更是提升实验精准性与效率的重要保障。在实际操作中，我们应始终将光谱信息与仪器配置、荧光特性及实验目标相结合，做到“因光制宜、因器选色”，从而在多色流式的复杂光谱世界中游刃有余，最终获得可靠、清晰的实验结果。
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