abinScience助力浙江大学团队NbPro技术揭示NELF凝聚体动态调控热应激转录重启

在真核生物中，RNA聚合酶 II（RNA Pol II）的转录过程受到严格调控，RNA Pol II在起始后，往往会停留在启动子附近，形成所谓的“启动子近端暂停（Promoter-proximal pausing）”。这一过程由负延伸因子（NELF）和DRB敏感性诱导因子（DSIF）共同维持，对精准控制基因表达至关重要。已有研究发现热应激会诱导NELF形成核凝聚体，但这类凝聚体的动态调控机制及其与转录适应的关联仍不明确，且NELF在热应激转录抑制中的具体作用存在争议。

此外，传统邻近标记技术在研究应激条件下生物分子凝聚体时，存在融合标签干扰蛋白功能、标记半径过大或时间分辨率低等局限，制约了凝聚体邻近蛋白质组的精准解析。近期，浙江大学卢华松团队在《Molecular Cell》发文“HSPA1A and DNAJB1 regulate NELF condensate dynamics to safeguard transcriptional recovery under heat stress”，开发新型邻近标记技术NbPro，鉴定出HSPA1A与DNAJB1是NELF凝聚体核心调控因子，二者通过特异性结合维持NELF凝聚体动态可逆，调控NELFA磷酸化循环与染色质结合，稳定RNA Pol II启动子近端暂停，保障热应激后转录高效恢复。

_{Figure 1. Graphical abstract}

为克服传统APEX2融合标记技术的缺陷，研究团队开发了基于纳米抗体的邻近标记策略NbPro。通过抗ALFA纳米抗体与APEX2融合，在细胞固定后靶向 ALFA标签修饰的目标蛋白，实现原位生物素化。实验证实NbPro-1具有更强的过氧化物酶活性，且通过添加蔗糖和DTT可有效缩小标记半径。NbPro克服了传统技术对蛋白质功能的干扰，提升了空间分辨率，是解析生物分子凝聚体邻近蛋白组的可靠工具。

_{Figure 2. NbPro的建立}

利用NbPro技术对热应激（HS）和非热应激（NHS）条件下NELFA凝聚体的邻近蛋白组进行分析，共鉴定出728个特异性富集蛋白。GO功能富集分析显示，这些蛋白高度富集于染色质结合、转录延伸等过程。邻近连接实验（PLA）与荧光共定位实验进一步证实，分子伴侣HSPA1A和DNAJB1在热应激下与 NELFA紧密结合。明确了分子伴侣HSPA1A和DNAJB1是热应激诱导的NELF凝聚体的核心组成部分。

_{Figure 3. 在HS应力下对NELF凝聚物的NbPro分析}

实验发现，NELF与HSF1形成的凝聚体在空间上相互独立，HSF1敲低（KD）不影响热应激诱导的NELF凝聚体形成，但会导致恢复阶段凝聚体持续存在、无法溶解。1,6-己二醇处理及FRAP实验显示，当HSF1-HSPA1A/DNAJB1轴受损时，NELF凝聚体对己二醇产生抗性，且NELFA的流动性显著下降，表明凝聚体由液态转变为凝胶或固体状。结果表明HSF1通过诱导分子伴侣HSPA1A/DNAJB1的表达，维持NELF凝聚体的液体样动态和可逆性，防止异常聚集。

_{Figure 4. HSF1-HSPA1A/DNAJB1轴维持HS诱导的NELF凝聚体的可逆性}

通过LacO/LacI tethering实验，研究者发现NELFA的触手结构域（Tentacle domain）负责招募分子伴侣。进一步研究证实，DNAJB1的C端结构域（CTD）与该触手结构域结合，进而介导HSPA1A的招募。体外液滴形成实验显示，HSPA1A与DNAJB1协同作用可显著抑制NELFA的液-液相分离，提升液滴流动性。DNAJB1作为共伴侣，通过与NELFA触手结构域结合并招募HSPA1A，协同调控NELF凝聚体的动态特性。

_{Figure 5. DNAJB1与NELFA触手结构域之间的相互作用促进HSPA1A整合到NELF凝聚物中}

Phos-tag凝胶分析显示，热应激诱导NELFA发生依赖MEK1/2通路的动态磷酸化。实验证明，当HSPA1A/DNAJB1功能缺失导致凝聚体动力学受损（无法解离）时，恢复阶段的NELFA去磷酸化过程被显著阻断。HSPA1A/DNAJB1通过调控NELF凝聚体解离，促进磷酸酶对NELFA的去磷酸化，维持磷酸化循环的平衡。

通过构建NELFA的16A突变体（突变16个潜在磷酸化位点），ChIP-Rx、TT-seq及GRO-seq联合分析显示，DNAJB1缺失或HSP70抑制会削弱NELF在启动子区的结合，导致RNA Pol II从暂停位点异常逃逸。这些逃逸的复合物是非生产性的，最终导致热应激后的转录完成率显著降低。NELF介导的暂停并非单纯的转录抑制，而是作为质量控制检查点，通过阻止未成熟RNA Pol II异常逃逸，保障转录保真度。

C??H??N?O?（5-EU）标记及瞬时转录组测序（TT-seq）实验显示，NELF对热应激初期的转录抑制并非必需，但对恢复阶段的转录重激活至关重要。DNAJB1缺失导致NELF介导的“暂停”机制失效，RNA Pol II从位点异常逃逸至基因体。这些逃逸的Pol II呈现非生产性，导致伸长指数（EI）无法回升，严重影响转录恢复。表明NELF介导的暂停是转录保真度的关键检查点，通过阻止未成熟RNA Pol II异常逃逸保障转录重启。

_{Figure 8. NELF介导的RNA聚合酶II暂停被破坏，导致未成熟RNA聚合酶Ⅱ从暂停位点逃脱，从而影响HS后的有产出转录重启}

本研究通过开发新型邻近标记技术NbPro，克服了传统融合标签的功能干扰，实现了对应激条件下生物分子凝聚体的高分辨率原位解析。研究揭示了HSF1-HSPA1A/DNAJB1-NELF调控轴，证实分子伴侣通过结合NELFA触手结构域及维持磷酸化循环平衡，保障了NELF凝聚体的液体样动态与可逆性。

abinScience为实验提供了核酸酶（Benzonase nuclease，货号 JN844012），用于染色质组分免疫沉淀（Chromatin fraction IP）实验中，可高效消化染色质相关核酸，助力分离并富集与目标蛋白结合的染色质片段，为后续免疫沉淀及蛋白质相互作用分析提供了关键技术支撑。