一、外泌体介绍
外泌体（Exosomes）是细胞分泌到胞外的一种纳米级囊泡（Extracellular Vesicles，EVs），其大小仅30-150nm，大小与某些病毒接近，但不具备自主复制能力，本质上是细胞分泌的囊泡。它们如同细胞派出的 “纳米信使” ，具有双层膜结构，内部装载着丰富的“信息”（包括核酸、蛋白和脂质等），在细胞之间穿梭，精准地参与细胞间的分子传递与通信。
2013年，诺贝尔生理学或医学奖授予了美国科学家詹姆斯·罗思曼、兰迪·谢克曼及德国科学家托马斯·祖德霍夫，表彰他们在细胞间囊泡运输调控机制领域作出突出贡献，将外泌体研究的热度推向高潮。
外泌体（Exosome）是由大多数细胞分泌的小膜泡。内泡由细胞室向内出芽形成，称为多泡体(MVB)。当MVB与质膜融合时，这些内部的囊泡被释放为外泌体，外泌体可以将DNA、RNA和蛋白质转移到远处的受体细胞，并影响细胞行为和生理的各个方面。
外泌体广泛存在于细胞培养上清以及各种体液中，包括血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁等，同时也存在于组织样本中，如脑组织、肌肉组织、脂肪组织等。
图1. 外泌体结构展示（DOI:10.3390/biology10040285）
二、流式细胞术检测外泌体
由于外泌体的纳米级尺寸超出了传统流式细胞仪的光学检测极限，因此需要特殊策略对其进行有效检测。目前主流方法如下：
1.微球捕获放大检测
在微球上预包被外泌体特异性抗体（如：CD9、CD63、CD81等），再使用微球进行外泌体的捕获，捕获后与带荧光标记的二抗（针对另一个外泌体表面抗原或针对一抗的种属）结合，最后通过流式细胞仪检测，从而来反映外泌体的情况。这样的好处在于可以精准的检测出外泌体，并且适用于大部分流式细胞仪。
图2：微球检测外泌体实验原理
2. 纳米流式检测法
一些高精度流式细胞仪（如：Beckman的CytoFLEX nano 纳米流式分析仪、ApogeeFlow 的MicroPLUS / Micro等）可以直接检测外泌体。这些仪器在传统流式的基础上把光学、探测器和软件做高灵敏度优化，使仪器能对几十到几百纳米的单个纳米颗粒（如外泌体）产生可测的散射或荧光信号，从而实现单颗粒计数、大小估算与表面标志物检测。
图3. 流式细胞术鉴定粒径和外泌体表面标志蛋白（图片来源：Beckman官网）
A. 标准化微球进行仪器校准。B. 外泌体样品粒径分布情况。C. 加入 Triton X-100 后粒径分布情况。D. PE-CD81或APC-CD63标记外泌体的表征率分析。
三、流式细胞术检测外泌体实验注意事项
1. 充分清除杂质：在上机前，先通过低速离心或过滤去除细胞碎片和大颗粒，减少背景信号。
2. 选择更亮的荧光标记：选择PE、APC等高亮染料标记的抗体和高亮的膜亲和荧光染料（如PKH、DiI），将外泌体“染亮”。注意去除多余染料，避免假信号。
3. 稀释样品：外泌体容易出现“swarm效应”，即多个小颗粒被当成一个事件。通过适当稀释样品并检查信号线性，可以避免这个问题。
4. 合理的对照设置：流式细胞术检测外泌体需要设置以下几种对照：
① 未染色对照： 用于调节电压和设定阴性群边界。
② 同型对照： 区分特异性与非特异性抗体结合。
③ 荧光扣除对照（FMO）： 多色实验时尤为重要。
④ Triton X-100破膜对照： 用去垢剂破坏外泌体膜结构后，真正的阳性信号应显著减弱或消失，此对照是验证信号特异性的关键
5. 仪器校准与标准化：用已知大小和浓度的荧光微球校准仪器，可估算外泌体大小与浓度，提高可比性。
四、其他外泌体检测方式
除了流式细胞术，外泌体的检测与表征还可通过以下常用方法进行：
荧光染料标记示踪法：利用亲脂性荧光染料（如PKH67、PKH26、DiI、DiD、DiO等）与外泌体的脂质膜稳定结合，从而对其进行了荧光标记。标记后的外泌体可用于体外或体内研究，通过共聚焦显微镜、高内涵成像系统或活体成像系统追踪其被受体细胞的摄取情况、在生物体内的分布与归巢，是研究外泌体功能的重要工具。
电镜观察：通过电镜（透射电子显微镜TEM/扫描电子显微镜SEM等）观察样品中的颗粒形态、大小、结构等来鉴定外泌体。
Western Blot：通过检测外泌体标志蛋白（如CD9、CD63、CD81、TSG101、Alix等）来对分离的外泌体群体进行蛋白质水平的鉴定。
酶联免疫吸附测定（ELISA）：利用外泌体表面特异性抗体进行捕获和检测，适用于外泌体的特异性定量分析。
五、abinScience外泌体相关流式抗体推荐
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Target |
Clone |
CAT. |
Species |
Application |
|
CD9 |
SAA0003 |
HB984127 |
Human |
FCM, ELISA, WB |
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CD63 |
MOF11 |
HY592127 |
Human |
FCM, ELISA, WB |
|
CD63 |
SAA1394 |
HY592227 |
Human |
FCM |
|
CD81 |
5A6 |
HX855127 |
Human |
FCM, WB |
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参考文献
[1] Kim, G., Shon, O. J., Seo, M. S., Choi, Y., Park, W., & Lee, G. W. (2021). Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes and Their Therapeutic Potential for Osteoarthritis. Biology, 10(4), 285.
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