【流式研习社 4】流式对照体系：构建数据可靠性的完整逻辑链

流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是一种高效、精确的细胞分析技术，广泛应用于细胞免疫表型分析、细胞周期检测、细胞死亡机制研究等多个领域。在流式实验中，合理的对照设置是确保数据准确性和可靠性的关键，前面已经介绍了：单染对照，同型对照，FMO对照（点击蓝字回顾），这些对照为数据分析提供了坚实的基础，帮助研究人员确保数据的准确性和可重复性。然而，流式实验的对照远不止这几个，那流式实验到底需要多少种对照设置，如何进行合理选择，以保证数据分析的全面性和可靠性呢？

一、流式实验中的其他对照类型

1. 空白对照（Blank Control）

空白对照是一种最基础最常用的对照类型，它是不添加任何荧光标记物的对照管。其功能有：①调节各通道电压，使细胞信号位于合理的检测范围起点；②评估细胞自发荧光，识别样本的本地信号；③评估仪器和试剂的背景噪声，排除非特异性信号的干扰。

2. 死活对照（Live/Dead）

死细胞的破损膜结构可能导致荧光标记物的非特异性结合或信号增强，从而增加背景噪音。。使用死活染料将活细胞与死细胞区分开，并在分析时排除死细胞，是获得清晰、可靠结果的关键步骤。在许多情况下，排除死细胞对数据质量的提升，甚至比设置同型对照更为显著。

图1. 死细胞对流式实验结果的影响（DOI: 10.1016/j.jim.2006.04.007）

3. 生物学对照（Biological Control）

也叫实验对照，不用于设置补偿或设门，而是用于比较样本与特定实验条件下的标本之间的差别，帮我们确认观察到的现象，是否真的由实验干预引起的。例如，做细胞因子检测实验，为确定刺激阻断的效果，可以做一下未刺激阻断的对照，看相应的细胞因子变化情况，如图2所示。

图2. 未刺激阻断组（左）与刺激阻断组（右）效果对比

二、选择合适对照设置，确保数据可靠性

到此，我们一共介绍了7种不同的对照，流式实验有这么多的对照，在实际操作中我们每个对照需要做吗？不是的，我们应根据实际情况，实验设计和目的来选择对照类型。

为了更直观地了解如何在实际实验中使用这些对照设置，我们以五色（Live/Dead-Zombie Violet?、CD3-PerCP、CD4-FITC、IL-4-APC和INF-γ-PE）检测人类外周血单个核细胞（PBMC）中的Th1/Th2细胞亚群为例展示完整的流式实验需要设置多少个对照。

表1. 人PBMC 中Th1/Th2细胞亚群检测实验对照设置参考表

注意事项：

1. 实验一共有5种荧光，单阳对照尽量都做。

2. 表1将同型对照，FMO对照进行了合并，这是一种在保证数据质量的同时节省样本和试剂的高效策略。样本足够的情况下可以分开单独做同型对照和FMO对照。

3. 表1中只展示了两个FMO+同型对照，这是因为需要优先选择信号弱、分群不清的关键指标（如细胞因子、磷酸化蛋白、低表达抗原），CD3、CD4属于分群清晰的强阳性指标，可以不做。

4. 死活对照是加入死活染料来排除样本中的死细胞，它并不是一个单独的对照。

实验上机检测及数据分析逻辑链：

1. 根据空白对照调节各通道电压，确保仪器设置不变，依次上机检测各单阳对照、FMO+同型对照、生物学对照、实验组。

2. 根据单阳管数据调好补偿应用到所有样本

3. 圈门顺序：先圈出主细胞群，死活，去黏连（顺序可根据需要调整），根据marker之间的层级依次圈门：CD3/CD4圈出CD3+CD4+T细胞，然后在CD3+CD4+T细胞中分别圈出Th1细胞（INF-γ+），Th2细胞（IL-4+）（通过FMO+同型对照确定门的位置），最后对比实验组与生物学对照的差异。

4. 导出所需数据。

三、总结

流式细胞术是生物学研究中强大的分析工具，而合适的对照设置则是确保实验结果有效性和可靠性的基础。从空白对照、单染对照、同型对照、FMO对照等等，每一种对照在不同的实验设计中扮演着不同的角色，帮助研究人员排除干扰信号、优化补偿设置和验证实验方法。流式实验的对照设置，其终极目标不是填满试管架，而是为了构建一条从荧光信号到生物学结论的、清晰且可信的逻辑路径。

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