流式实验结果的准确性不仅取决于抗体选择和仪器设置，样本本身的状态同样至关重要。死细胞由于其膜通透性变化，常会导致抗体非特异性结合；同时死细胞还会导致细胞自发荧光增强，从而引入假阳性信号并模糊细胞群的分界。这种干扰在检测稀有细胞群或低表达抗原时尤为显著。
死细胞膜完整性受损后，胞内大量带电荷的组分及非特异性抗原表位暴露，会与荧光标记抗体发生非特异性吸附，导致假阳性信号的产生。
图1. 死细胞导致假阳性信号
细胞死亡过程中，线粒体、溶酶体等细胞器释放的代谢产物（如黄素类、脂褐素）可显著增强细胞的自发荧光。这种自发荧光具有宽谱特性，可溢漏至多个检测通道，导致背景信号升高。在有些实验结果中会表现为沿对角线分布的信号。这也是识别死细胞干扰的一个重要特征。
图2. 死细胞沿对角线分布示意图
上述两种效应叠加，会导致目标细胞群在散点图上呈现斜向拖尾或与边界不清，影响圈门的准确性和可重复性，尤其在检测稀有细胞或弱表达抗原时，可能造成细胞漏检或误计。
图3. 未染死活和CD45导致CD11b+F4/80+的巨噬细胞群分群不清晰及CD206异常升高
常用死活染料可根据实验需求分为两类：
核酸染料基于细胞膜完整性：活细胞能够排斥染料，而死细胞膜破损后，染料进入细胞并与DNA结合，产生荧光。此类染料适用于不涉及固定破膜的样本直接检测。细胞在固定处理后，细胞膜通透性改变，染料会进入活细胞，导致无法区分死活。
图4. 固定前后PI染色结果对比
胺基活性染料通过共价结合蛋白质标记细胞。细胞膜破损后，染料进入死细胞内标记大量蛋白质，使荧光强度明显高于仅标记膜表面蛋白的活细胞。此类染料能够耐受后续的固定和破膜处理，适用于需要胞内染色的复杂实验方案。
图5. 胺基活性染料区分死活细胞原理
在实验设计阶段，应首先确认是否需要固定或破膜处理，从而选择合适的染料类型。
| 死活染料类型 | 核酸类死活染料 | 胺基活性染料 |
| 染色原理 | 细胞膜非通透性核酸染料，可进入细胞膜受损的细胞并与dsDNA/RNA结合，但不能穿透完整细胞膜。 | 细胞膜非通透性胺基活性染料，与位于细胞内外的细胞蛋白上的伯胺基团共价结合。只与细胞表面的氨基蛋白结合时，仅产生微弱的信号；然而，当染料通过受损的质膜进入细胞并与细胞内部的氨基蛋白反应时，产生的信号非常强。 |
| 染色顺序 | 表染后，上机前 | 表染前 |
| 是否可染色后固定 | 否 | 是 |
| 荧光颜色选择 | 少，配色受限 | 多，灵活配色 |
| 常见染料 | PI, 7AAD, DAPI | Invitrogen? LIVE/DEAD可固定死细胞染色剂，eBioscience? Fixable Viability Dye（即用型细胞活性判断染料，可用于胞内染色的死活染料） |
| 其他特点 | 发射波谱比较宽，与其他通道干扰较大；占用较好的通道；PI等染料黏性大；不可用于需固定细胞的流式检测。 | 有多种荧光标记可以选择，灵活加入配色panel；避免细胞容易成团的问题，不易堵塞流式仪器管路。 |
胺基染料也是需要通过梯度滴定确定最佳工作浓度，目标是实现活细胞与死细胞的最大分离度（Stain Index），而非单纯追求荧光强度。浓度过高会提高活细胞背景，过低则无法充分标记死细胞。对新批次染料，应进行滴定实验以保证一致性。
胺基染料结合蛋白质，高浓度蛋白（如血清、BSA）会竞争染料结合，削弱阳性信号。因此，染色应在不含蛋白的缓冲液（如PBS）中进行，完成后再使用含蛋白缓冲液洗涤封闭。
在设计多参数panel时，应考虑死活染料通道可能对其他检测通道造成的信号扩散（Spreading Error）。合理安排染料组合有助于减少弱表达抗原检测的干扰。
死活染色是流式实验质控的关键环节。通过合理选择染料类型、滴定确定最佳浓度，并严格控制染色条件，可以有效排除死细胞干扰，提高实验数据的准确性与可重复性，也为科学结论提供可靠基础。
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live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J Immunol Methods.
2006 Jun 30;313(1-2):199-208. doi: 10.1016/j.jim.2006.04.007. Epub 2006
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