1. mTOR 通路在“指标库”里的定位：从框架到实战
在信号通路总览中，我们已将 PI3K/AKT/mTOR 定位为生长因子、营养与能量信号的交汇枢纽。本篇聚焦实战指导，围绕核心问题提供可操作建议：
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实验中应优先检测哪些位点，以获得最大信息量？
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这些位点如何对应上游、mTORC1、mTORC2、自噬及能量调控层面？
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在 Western blot、流式细胞术、免疫组化/荧光等平台上，哪些 readout 最可靠且易操作？
说明：readout 指实验直接可测的指标，如特定位点磷酸化、蛋白核转位或自噬通量变化。
图1. PI3K–AKT–mTOR 通路简化示意图，标注常用 readout（如 p-AKT、p-mTOR、p-S6K、p-S6、p-4E-BP1、p-ULK1、LC3-II/p62、p-AMPK），便于按上游–核心–下游快速定位。
2. 一眼看懂：mTOR 通路核心 readout 列表
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指标类别
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常用位点 / 读出
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代表意义
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推荐方法
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使用提示（含常见误区）
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mTOR 整体激活
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p-mTOR (Ser2448)
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反映 PI3K–AKT 上游及营养信号整合的 mTOR 激活水平
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Western blot、IHC
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适合概览，但不宜单独依赖判断通路状态；需结合下游如 p-S6K 或 p-4E-BP1 验证实际活性。
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mTORC1 直接下游
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p-p70S6K (Thr389)
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最经典、最可靠的 mTORC1 活性指标
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Western blot；部分抗体支持流式
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对氨基酸、雷帕霉素及 ATP 竞争抑制剂高度敏感；建议配总 S6K 内参，避免表达变化干扰。
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翻译延伸调控
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p-S6 (Ser235/236 或 Ser240/244)
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反映核糖体蛋白翻译活性，常用于组织水平评估
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Western blot、IHC、IF、流式
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IHC 中特别直观，可显示肿瘤增殖区 mTORC1 高活；注意可能部分受 RSK 等其他通路影响。
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翻译起始调控
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p-4E-BP1 (Thr37/46、Thr70、Ser65)
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控制 eIF4E 释放，直接决定帽依赖翻译启动
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Western blot
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多磷酸化导致迁移带上移；观察整体带型偏移更可靠，Thr37/46 为雷帕霉素不敏感位点。
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自噬抑制节点
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p-ULK1 (Ser757)
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mTORC1 对自噬起始的直接抑制
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Western blot
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与 LC3-II/p62 联用判断 mTOR 依赖自噬；区分 AMPK 激活位点 (Ser317/777)，方向相反。
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自噬通量
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LC3-II 积累 / p62 降解
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自噬体形成及底物降解
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Western blot、IF
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必须加溶酶体抑制剂 (BafA1 或 CQ) 测通量；单看 LC3-II 增加易误判为通量增强而非阻滞。
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上游 / mTORC2
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p-AKT (Thr308 / Ser473)
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Thr308 反映 PDK1，Ser473 专属 mTORC2 活性
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Western blot、流式
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联用可区分上游问题；流式适合单细胞亚群分析。
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能量应激交叉
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p-AMPK (Thr172)
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能量低时激活，抑制 mTORC1
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Western blot
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与 p-S6K 联用解释“无药物情况下 mTOR 关闭”原因，如饥饿或缺氧。
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3. 组合搭配思路：构建证据链
实验设计时，避免“一网打尽”，优先选连贯证据链：上游激活 → mTORC1/2 响应 → 下游翻译/自噬改变。
3.1 Panel A：生长因子/血清刺激
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推荐： p-AKT (Thr308 + Ser473) + p-S6K + p-S6
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适用：验证 EGF/IGF-1 或血清是否经 PI3K–AKT–mTOR 拉通路
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读图： p-AKT 峰值常在 5–15 min，继而 p-S6K 上升；若 p-AKT 升而 p-S6K 不动，检查氨基酸/能量限制。
3.2 Panel B：mTOR 抑制剂验证
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推荐： p-S6K + p-S6 ± p-4E-BP1（双抑制剂加 p-AKT Ser473）
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适用：评估雷帕霉素或 ATP 竞争抑制剂有效性
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读图： p-S6K/S6 下降即为 mTORC1 抑制证据；双抑制剂若 p-AKT Ser473 降，则 mTORC2 亦被击中。
3.3 Panel C：自噬调控
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推荐： p-ULK1 (Ser757) + LC3-II/p62 (加 BafA1) + p-AMPK ± p-S6K
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适用：判断自噬是否主要经 mTOR–ULK1
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读图：能量应激典型：p-AMPK↑、p-S6K↓、p-ULK1 Ser757↓ → LC3-II↑、p62↓。
3.4 Panel D：代谢/肿瘤模型
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推荐： p-AKT Ser473 + p-S6 + p-4E-BP1 ± 代谢指标
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适用：评估慢性高营养下 mTOR 持续激活
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读图：常见 p-AKT Ser473 与 p-S6 持续高；加 p-AMPK 观察能量应激是否被抑制。
4. 不同平台指标选择
图2. Western blot 典型结果示例：显示 p-S6K、p-S6、p-4E-BP1、LC3-II 等磷酸化条带变化。
图3. 肿瘤组织 p-S6 IHC 染色，显示 mTORC1 活性空间异质性。（注：原图中左侧为流式示例，此处仅保留 IHC 部分以匹配说明）
4.1 Western blot：动态扫描优选
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优势：可同时测磷酸化 + 总蛋白，观察迁移带及时间/剂量梯度
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推荐： 全套磷酸化 + 总蛋白内参
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提醒： 通路内成对检测 p- + total；时间点建议 0–60 min。
4.2 流式细胞术：单细胞异质性
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优势： 分群分析（如免疫细胞亚群）
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推荐： p-AKT Ser473、p-S6、p-S6K
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应用：肿瘤浸润免疫细胞 mTOR 状态
4.3 IHC/IF：组织空间信息
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优势： 显示区域差异（如肿瘤核心 vs 边缘）
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推荐： p-S6（金标准）、p-mTOR、LC3/p62
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应用： 给药后肿瘤组织药效评估
5. 小结：mTOR 通路“必备四件套”
最小精简 panel（覆盖大部分场景）：
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p-AKT (Ser473)：上游 + mTORC2
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p-p70S6K 或 p-S6：mTORC1 核心活性
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p-4E-BP1：翻译起始补充
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LC3-II/p62 (± p-ULK1 + BafA1)：自噬相关时必加
在此基础上，按需扩展 p-AMPK 等。掌握这些，即可高效“拉通路”并评估功能输出。下一篇将继续拆解另一高频通路NF-κB。
参考文献
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