流式细胞术（Flow Cytometry）作为一种强大的细胞分析工具，广泛应用于免疫学、肿瘤学、干细胞研究等领域。流式细胞术实验结果的准确性在很大程度上依赖于实验的配色方案。一个优秀的配色方案能够在最大化信号分辨率的同时，最小化荧光干扰。本文将直接围绕流式配色的核心环节：目标Marker的选择，流式细胞仪的配置，如何利用荧光素信息合理搭配目标Marker，并结合具体方案把手教你设计出信号清晰、背景干净、数据可信的多色流式方案。
在流式细胞术中，最基本的任务是确定检测哪些细胞群体需要被检测，以及每个细胞群体的具体标志物。因此，我们需要明确以下四个问题：
要检测的细胞群体是什么？（如T细胞、B细胞、NK细胞）
哪些是目标群体的标志？（如CD45用于圈定淋巴细胞）
哪些是目标的功能性或状态标志物？（如Treg细胞需要CD25，Foxp3）
各标志物的表达水平如何？（高、中、低）
表1. 常见免疫细胞标记物
| 细胞类型 | 人源标志物 | 小鼠源标志物 |
|---|---|---|
| 白细胞共同抗原 | CD45 | CD45 |
| 造血干细胞 | Lin(-)，CD34，CD38(-)，CD90，CD117 | Lin(-/low)，Sca-1，CD117，CD150 |
| B细胞 | CD19，CD20 | CD19，B220(CD45R) |
| T细胞 | CD3 | CD3 |
| 辅助性T细胞 | CD3，CD4 | CD3，CD4 |
| 细胞毒性T细胞 | CD3，CD8 | CD3，CD8 |
| 调节性T细胞 | CD4，CD25，Foxp3，CD127(low/-) | CD4，CD25，Foxp3 |
| 树突状细胞 | CD11c，MHC class II，CD141，CD209 | CD11c，MHC class II |
| 自然杀伤细胞 | CD3(-)，CD16，CD56 | CD3(-)，NK1.1(限品系)，CD49b(DX5) |
| 单核细胞 | CD14，CD16(±) | CD11b，CD115，Ly-6G(Gr-1) |
| 巨噬细胞 | CD11b，CD68 | F4/80，CD68 |
| 巨核细胞/血小板 | CD41，CD42a，CD42b，CD61，CD62P | CD41，CD61，CD62P |
| 红细胞 | CD235a | TER-119 |
| 中性粒细胞 | CD11b，CD15，CD16 | CD11b，Ly-6G(Gr-1) |
| 嗜酸性粒细胞 | CD11b，CD193，Siglec-8，EMR1 | CD11b，CD193，Siglec-F，F4/80 |
| 嗜碱性粒细胞 | FcεRIα，CD123，CD203c，CD117(-) | CD49b，FcεRIα，CD200R3 |
图1. 常见人类表面抗原的密度
在进行多色流式实验前，必须清楚流式细胞仪的配置。不同品牌和型号的滤光片设置各异，通过仪器配置的信息，确认可以选择哪些荧光素。常见激光器如表2所示。
表2. 流式细胞术中的常见激光器
| 激光器 | 波长 | 激光器的常用荧光素 |
|---|---|---|
| 紫外(UV) | 355 nm | DAPI，Hoechst，LIVE/DEAD Blue，BUV系列 |
| 紫色 | 405–407 nm | Pacific Blue，eFluor 450，Pacific Orange，eFluor 506，Super Bright系列，BV系列，CFP |
| 蓝色 | 488 nm | FITC，Alexa Fluor 488，Dylight 488，PE，PE tandems，PerCP，PerCP tandems，PI，7AAD，eGFP，YFP |
| 绿色 | 532 nm | PE，PE tandems，Alexa Fluor 532，PI，mCherry，RFP |
| 黄色 | 561-568 nm | PE，PE tandems，PI，mCherry，RFP |
| 红色 | 633-647 nm | APC，Alexa Fluor 647，Alexa Fluor 700，APC tandems |
前面我们通过仪器配置知道了仪器可以检测哪些荧光素，然后我们就需要通过荧光素的相关参数（激发光谱、发射光谱、相对亮度等等）来确定哪些荧光素是可以在一个panel中兼容的。激发光谱与发射光谱重叠严重的不可以在一个panel中使用，尽量选择激发光谱和发射光谱重叠较小的荧光素。
更多荧光素选择信息请查看：如何看懂光谱图：流式细胞术多色panel设计的关键
表3. 常见荧光素信息
| 荧光素 | 最大激发光（nm） | 最大发射光（nm） | 相对亮度 |
|---|---|---|---|
| FITC | 495 | 519 | Moderate |
| PE | 496；565 | 578 | Very Bright |
| PerCP | 490 | 675 | Dim |
| APC | 650 | 660 | Bright |
图2. 常见荧光素光谱图
确定了需要检测哪些Marker，需要用到哪些荧光素，接下来就需要将荧光素与Marker搭配起来。荧光染料亮度有强弱之分，Marker表达有高低区别。流式配色的“黄金法则”就是：强弱搭配，亮度更高的荧光染料搭配低丰度Marker，亮度较低的荧光染料与高丰度Marker匹配。
图3. Human CD3- FITC与Human CD3- PE检测结果对比
图4. Mouse Foxp3- AF488与Mouse Foxp3- BV421检测结果对比
图3和图4的对比结果可以看出，高丰度Marker用选择强荧光素或者弱荧光素对结果影响不大，但是低丰度Marker用低亮度荧光素，就会导致阳性细胞群信号不明显。
表4. 不同丰度Marker与荧光素搭配建议
| Marker | 建议搭配荧光 |
|---|---|
| CD3、CD4、CD8等（表达稳定且高表达） | PerCP、FITC等相对偏弱的荧光 |
| CD27、CD28、CD45RA等（高表达，但经常连续性表达） | PerCP/Cy5.5等相对中等的荧光素 |
| CD25，STAT5，Foxp3、CD127等（低水平表达、激活性Marker、未知但关键） | PE、APC等强荧光素 |
我们以最常见的FITC、PE、APC、PerCP这四种荧光素为例，展示不同实验方案的配色。这四种荧光素光谱重叠度较小，而且可以适配市面上大部分的流式细胞仪。
检测的目标是T细胞、B细胞、NK细胞，这三种细胞都是淋巴细胞，淋巴细胞Marker是CD45，T细胞Marker是CD3，B细胞是CD19，NK细胞的Marker是CD56，这四个指Marker表达量从高到底分别是：CD45＞CD3＞CD19＞CD56，根据表3的亮度信息按照强弱搭配原则配色结果如表5所示：
表5. 人外周血T/B/NK细胞检测配色表
| Marker | 荧光素 | abinScience货号 |
|---|---|---|
| CD45 | PerCP | HY195147 |
| CD3 | FITC | HY057617 |
| CD19 | APC | HB996337 |
| CD56 | PE | HY309227 |
实验结果：
图5. 人外周血裂解红细胞后检测T/B/NK细胞结果
检测的目标是小鼠脾脏Treg细胞，Treg细胞的Marker是：CD4+CD25+ Foxp3+，CD25、Foxp3属于弱表达指标，需要搭配强荧光素APC和PE， CD4可以表达量高，可以用PerCP或FITC。配色结果如表6所示：
表6. 小鼠脾脏Treg细胞检测配色表
| Marker | 荧光素 | abinScience货号 |
|---|---|---|
| CD4 | FITC | MF998117 |
| CD25 | APC | MF996137 |
| Foxp3 | PE | MV388127 |
实验结果
图6. 小鼠脾脏Treg细胞检测结果
合理的配色是确保流式细胞术实验数据准确性和可靠性的关键。通过充分了解实验目的、流式细胞仪配置和荧光染料的特性，科学合理地搭配荧光染料，能够有效提升实验灵敏度和信号检测能力。
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