小鼠脾脏单细胞悬液制备

一、实验前材料准备

① 手术器械：包括眼科剪、眼科镊等。

② 培养皿：一次性塑料培养皿。

③ 滤网：70 μm或200目滤网用于过滤细胞团块，保证得到单细胞悬液。

④ 离心管：15 mL或50 mL的离心管，用于收集和离心细胞。

⑤ PBS 或培养基：用于清洗细胞。

⑥ 红细胞裂解液：用于去除红细胞。

备注：如果细胞后续用于培养请将材料消毒，保证无菌。

二、小鼠脾脏获取

颈椎脱臼法处死小鼠，75%乙醇浸泡5 min，取出小鼠置于操作台上，左腹侧朝上。小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏（图1）。从脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露出脾脏。用镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏，并浸泡于干净的PBS溶液中。

图1. 小鼠脾脏位置

三、脾脏单细胞悬液制备

1. 研磨法

① 用5 mL注射器活塞/柱塞的扁平末端部分或用研磨棒以温和画圆的方式研磨脾脏，碾磨至无明显红色结团。

② 70 μm或200目滤网过滤细胞，再用适量PBS/培养基冲洗滤网，收集细胞与离心管中。300-500 g离心5 min，弃上清。

③ 用适量红细胞裂解液重悬细胞，室温裂解2-3 min后，马上加入10 mL的PBS终止裂解，300-500 g离心5 min，弃上清。

④ 用PBS或培养基重悬细胞，计数，调整细胞浓度到1×10⁷/mL。

2. 吹打法

① 2.5 mL的注射器吸取PBS，小心插入脾脏中吹打，至脾脏细胞完全被吹打干净，观察只剩余白色的结缔组织和脂肪组织为止，镊子夹取剩余的白色组织在PBS中轻轻润洗。

② 70 μm或200目滤网过滤细胞，再用适量PBS/培养基冲洗滤网，收集细胞与离心管中。300-500 g离心5 min，弃上清。

③ 用适量红细胞裂解液重悬细胞，室温裂解2-3 min后，马上加入10 mL的PBS终止裂解，300-500 g离心5 min，弃上清。

④ 用PBS或培养基重悬细胞，计数，调整细胞浓度到1×10⁷/mL。

图2. 小鼠脾脏FSC/SSC结果图

四、注意事项

① 研磨力度尽量轻柔，避免造成过多机械性死亡的细胞。

② 收集的脾脏细胞如需进一步培养，请注意无菌操作；如果只是做普通的流式实验，则可以不考虑无菌环境。

③ 红细胞裂解最好现配现用，裂解时间以实验过程中裂红的效果来判断。

④ 细胞计数可以使用血细胞计数板或者自动细胞计数仪来计数细胞。

⑤ 为保持细胞活性，减缓代谢，尽量全程低温操作（在冰上或4℃环境）。

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