abinScience助力华中科技大学揭示磷脂酰丝氨酸外翻红细胞膜囊泡增强人工血管胞葬与重构机制

小口径血管移植物（内径＜6 mm）的临床缺口是心血管外科领域长期未解决的难题。自体血管取材有限、供区损伤风险高，而现有合成材料（如ePTFE）面临持续炎症、钙化和内膜增生等问题，至今仍无理想的小口径人工血管产品进入临床。红细胞膜囊泡（EMVs）因其良好的生物相容性和免疫逃逸特性，已被广泛用于纳米药物递送。然而，这一"don't eat me"策略仅利用了红细胞膜的被动免疫属性，其主动免疫调控潜力尚未开发。

磷脂酰丝氨酸（PS）是一种保守的凋亡信号分子，正常状态下被限制在细胞膜内叶，一旦外翻至外叶，即成为巨噬细胞识别的"eat me"信号，启动吞噬清除过程（即efferocytosis，胞葬作用）。华中科技大学研究团队发表于《Nature Communications》的一篇文章提出了一种全新策略：通过磷脂酰丝氨酸外翻方法（PEM）制备PS外翻红细胞膜囊泡（PS-EMVs），将其修饰于小口径血管移植物表面，主动激活免疫胞葬通路，实现免疫调控介导的血管组织再生。

PS-EMVs的制备与表征

研究人员首先从兔全血中分离纯化红细胞，采用低渗处理结合超声处理的磷脂酰丝氨酸外翻方法（PEM）制备PS-EMVs。透射电镜（TEM）显示，PS-EMVs呈标准纳米囊泡形态，平均粒径约134 nm，小于传统机械挤出法（CEM）制备的EMVs（约230 nm）；两者Zeta电位相近，均呈负电性。荧光共定位分析显示，PS-EMVs中DiI信号与Annexin V-FITC标记的PS信号共定位率显著高于EMVs。流式细胞术进一步定量显示，约80.60%的PS-EMVs实现了PS外翻，远超CEM制备的EMVs。

研究者还使用abinScience提供的Anti-Phosphatidylserine Reference Antibody (Bavituximab, RUO)（货号 YP862016）对PS暴露进行高灵敏度的定量验证，结果与Annexin V检测一致，进一步确认了PS外翻的高效性。机制层面，ATP酶活性检测显示，PEM处理显著降低了维持膜磷脂不对称性的翻转酶ATP11活性，这是PS强制外翻的核心机制。

Figure 1. 超细金属颗粒(EMVs)和聚苯乙烯超细金属颗粒(PS-EMVs)的制备与表征

PS-EMVs对促炎巨噬细胞的免疫调控

确认PS-EMVs的结构特征后，研究者在RAW264.7巨噬细胞模型中验证其免疫调控功能。将DiI标记的PS-EMVs与EMVs分别加入巨噬细胞培养体系，荧光显微镜观察显示，巨噬细胞对PS-EMVs的吞噬速率从20分钟至4小时持续增加，显著高于EMVs组，证实PS外翻有效促进了胞葬摄取。

在LPS诱导的M1巨噬细胞模型中，PS-EMVs处理后，M1标志基因iNOS和IL-1β表达显著下调，M2标志基因CD206和YM1表达显著上调；ELISA检测显示促炎因子TNF-α分泌减少，抗炎因子IL-10分泌增加。Western blot分析进一步揭示，PS-EMVs能激活MerTK磷酸化并抑制NF-κB通路（p65磷酸化降低）；当用抗PS抗体封闭PS后，上述效应消失，证实PS-MerTK轴是调控炎症的关键通路。

Figure 2. PS-EMVs对促炎巨噬细胞的免疫调节机制

PS-EMVs修饰小口径血管移植物的构建

基于细胞水平验证，研究人员进一步将PS-EMVs整合至可植入器械中。以聚己内酯（PCL）为基材，通过静电纺丝制备小口径管状支架，依次经多巴胺（pDA）正电涂层修饰和PS-EMVs负电涂层吸附，最终获得PS-EMVs修饰血管移植物（PEMVG）。SDS-PAGE蛋白谱分析显示，PEMVG与EMVs修饰移植物（EMVG）蛋白组成高度一致。

荧光标记显示PS-EMVs均匀分布于移植物表面，蛋白定量结果显示每平方厘米吸附量约3.7 μg。体外循环系统模拟10天后，约10.91%的PS-EMVs仍保留于移植物表面，提示其具备持续信号释放能力。四组移植物（PCL、pDAG、EMVG、PEMVG）爆破压均远超生理血压范围（90-120 mmHg），pDA涂层还显著降低了BSA蛋白非特异性吸附并促进内皮细胞黏附。

Figure 3. 使用PS-EMVs(PEMVG)修饰的小直径血管移植物的构建

兔颈动脉置换模型的体内评价

研究者选用兔颈动脉置换模型，对四种移植物进行为期3个月的体内评价。多普勒超声随访显示，PEMVG和EMVG组通畅率均为100%，显著优于pDAG（83.3%）和PCL（83.3%）。HE和Masson染色显示，PEMVG组新生内膜致密、连续、均匀，厚度与天然血管相近；其他三组均呈现不均匀、松散的内膜结构。

免疫荧光染色显示，PEMVG组CD31阳性内皮细胞覆盖率显著优于其他组，α-SMA阳性平滑肌细胞层厚度与天然血管最为接近。补充分析还显示PEMVG显著降低M1巨噬细胞密度、提升M2巨噬细胞比例，并具有最强的抗钙化效果。

Figure 4. 在兔子颈动脉中进行PEIMVG的原位植入

犬颈动脉模型的转化前临床评价

为评估临床转化潜力，研究人员建立了比格犬颈动脉置换模型，以商用ePTFE移植物为对照，进行为期6个月的系统评价。多普勒超声显示，两组6个月通畅率均为100%，内径变化差异不显著。但在移植物取出后的精细分析中，PEMVG与ePTFE的差异明显：H&E和Von Kossa染色显示PEMVG管腔清晰无血栓、新生内膜均匀无钙化，而ePTFE组存在明显钙化沉积。

免疫荧光共染（vWF/α-SMA）显示PEMVG的内皮覆盖率和平滑肌层厚度均优于ePTFE。扫描电镜（SEM）观察到PEMVG内表面形成完整内皮形态，ePTFE内表面则存在明显血小板黏附。Western blot定量分析显示，PEMVG组M2/M1巨噬细胞比值更高，骨化相关蛋白Runx2和BMP2表达水平更低。

Figure 5. 犬类动物中PEMVG的临床前转化评估

单细胞RNA测序揭示胞葬调控机制

为在分子层面解析PEMVG的免疫调控机制，研究者对犬模型取出的移植物组织进行了单细胞转录组测序（scRNA-seq），整合分析共得到20,739个高质量单细胞转录组，涵盖内皮细胞、平滑肌细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞等11种细胞类型。巨噬细胞亚群分析将其分为9个亚群（MP0-MP8）。与ePTFE组相比，PEMVG组中MP0亚群比例显著升高。

KEGG通路富集分析显示，MP0亚群高度富集溶酶体、胞葬、吞噬体及胆固醇代谢通路，其中胞葬通路位列前10。关键标志基因分析（C1QA、C1QB、C1QC、CD36、TIMD4、STAB1）证实MP0为胞葬功能高度活跃的巨噬细胞亚群。进一步分析显示，MP0中IL-1β显著下调、CD163显著上调，提示该亚群具有强抗炎和促再生表型。LIPA、CD36、CTSS等关键基因在胞葬-吞噬体-溶酶体通路中的重叠表达，表明MP0介导了完整的序贯胞葬过程。

Figure 6. PEMVG通过单细胞RNA测序在血管重塑和再生过程中触发胞葬作用

结论

本研究通过工程化手段实现了红细胞膜磷脂酰丝氨酸的主动外翻，构建了具有高效胞葬诱导能力的生物界面。PEMVG移植物通过主动调控局部免疫微环境，成功解决了小口径人工血管领域的血栓与钙化难题，实现了从"免疫屏蔽"到"免疫调控再生"的转变。该策略为心血管生物材料的设计提供了严谨的理论支撑与预临床实验依据。

abinScience实验支持

abinScience为本研究提供了PS特异性抗体——Anti-Phosphatidylserine Reference Antibody (Bavituximab, RUO)（货号 YP862016），用于流式细胞术定量评估PS-EMVs表面磷脂酰丝氨酸的暴露水平，为PS外翻效率的高灵敏度验证提供了重要工具支撑。